حياة

غرام وصمة عار الإجراء في علم الأحياء الدقيقة

غرام وصمة عار الإجراء في علم الأحياء الدقيقة

وصمة عار الجرام هي طريقة تفاضلية للتلوين تستخدم لتعيين البكتيريا لإحدى المجموعتين (إيجابية الجرام وسالبة الجرام) بناءً على خصائص جدران خلاياها. ومن المعروف أيضا باسم تلطيخ الجرام أو طريقة الجرام. يدعى الإجراء للشخص الذي طور هذه التقنية ، عالم البكتيريا الدانماركي هانز كريستيان غرام.

كيف يعمل اللطخة غرام

يعتمد الإجراء على التفاعل بين الببتيدوغليكان في جدران الخلايا لبعض البكتيريا. تتضمن وصمة الغرام تلطيخ البكتيريا ، وتثبيت اللون بمورد ، وإزالة تلوين الخلايا ، وتطبيق طلاء مضاد.

  1. ترتبط البقعة الأساسية (البنفسجي البلوري) بالبيبتيدوغليكان ، وتلون الخلايا الأرجواني. كل من الخلايا إيجابية الجرام وسالبة الجرام لها ببتيدوغليكان في جدران خلاياها ، لذلك في البداية ، جميع البكتيريا تلوث بنفسجي.
  2. يتم تطبيق اليود الغرام (اليود ويوديد البوتاسيوم) على شكل مركب أو مثبت. خلايا إيجابية الجرام تشكل الكريستال البنفسجي اليود المعقدة.
  3. يستخدم الكحول أو الأسيتون لإزالة اللون عن الخلايا. تحتوي البكتيريا سالبة الجرام على ببتيدوغليكان أقل بكثير في جدران خلاياها ، لذا فإن هذه الخطوة تجعلها عديمة اللون بشكل أساسي ، في حين تتم إزالة بعض اللون فقط من خلايا إيجابية الجرام ، والتي تحتوي على مزيد من الببتيدوغليكان (60-90٪ من جدار الخلية). يتم تجفيف الجدار الخلوي السميك للخلايا الموجبة للجرام بخطوة إزالة اللون ، مما يتسبب في تقليصها ومحاصرة مجمع اليود الموجود داخلها.
  4. بعد خطوة إزالة اللون ، يتم استخدام مادة مضادة (عادة سافران ، ولكن في بعض الأحيان fuchsine) لتلوين البكتيريا الوردي. تلتقط كل من البكتيريا الموجبة السالبة في الجرام وسالبة الجرام اللطخة الوردية ، لكنها غير مرئية على اللون الأرجواني الداكن للبكتيريا الموجبة للجرام. إذا تم إجراء عملية التلوين بشكل صحيح ، فإن البكتيريا الموجبة للجرام ستكون أرجوانية ، في حين أن البكتيريا سالبة الجرام ستكون وردية.

الغرض من تقنية تلوين غرام

يتم عرض نتائج وصمة عار غرام باستخدام المجهر الضوئي. نظرًا لأن البكتيريا مُلونة ، فإنه لا يتم تحديد مجموعة اللطخة غرام فقط ، ولكن يمكن ملاحظة شكلها وحجمها ونمط التكتل. هذا يجعل الغرام وصمة عار أداة تشخيص قيمة لعيادة طبية أو مختبر. في حين أن البقعة قد لا تحدد البكتيريا بالتأكيد ، إلا أن معرفة ما إذا كانت إيجابية الجرام أو سلبية الغرام كافية لوصف مضاد حيوي فعال.

حدود التقنية

قد تكون بعض البكتيريا متغيرة الجرام أو غير محددة الجرام. ومع ذلك ، حتى هذه المعلومات قد تكون مفيدة في تضييق الهوية البكتيرية. هذه التقنية هي الأكثر موثوقية عندما تكون الثقافات أقل من 24 ساعة. في حين أنه يمكن استخدامه في ثقافات المرق ، فمن الأفضل أن تقوم بالطرد المركزي أولاً. القيد الأساسي لهذه التقنية هو أنها تعطي نتائج خاطئة إذا ارتكبت أخطاء في هذه التقنية. هناك حاجة إلى الممارسة والمهارة لإنتاج نتيجة موثوقة. أيضا ، قد لا يكون العامل المعدية بكتيرية. مسببات الأمراض حقيقية النواة وصمة عار سلبية الغرام. ومع ذلك ، فإن معظم الخلايا حقيقية النواة باستثناء الفطريات (بما في ذلك الخميرة) تفشل في التمسك بالشريحة أثناء العملية.

غرام تلطيخ الداخلي

المواد

  • البنفسجي الكريستال (وصمة عار الأولية)
  • اليود غرام (mordant ، لإصلاح البنفسجي الكريستال في جدار الخلية)
  • الإيثانول أو الأسيتون (مزيل اللون)
  • Safranin (وصمة عار الثانوية أو counterstain)
  • الماء في زجاجة بخ أو زجاجة بالقطارة
  • شرائح المجهر
  • المجهر المركب

لاحظ أنه من الأفضل استخدام الماء المقطر بدلاً من ماء الصنبور ، حيث إن فروق الأس الهيدروجيني في مصادر المياه قد تؤثر على النتائج.

خطوات

  1. ضع قطرة صغيرة من العينة البكتيرية على شريحة. قم بتسخين البكتيريا في الشريحة بتمريرها عبر لهب الموقد بنسن ثلاث مرات. يمكن أن يؤدي إذابة الكثير من الحرارة أو لفترة طويلة إلى إذابة جدران خلايا البكتيريا ، وتشويه شكلها ويؤدي إلى نتيجة غير دقيقة. إذا تم استخدام القليل من الحرارة ، فسوف تغسل البكتيريا الشريحة أثناء التلطيخ.
  2. استخدم قطارة لتطبيق وصمة عار الأساسية (البنفسجي الكريستال) على الشريحة والسماح لها للجلوس لمدة 1 دقيقة. شطف الشريحة بلطف بالماء لمدة لا تزيد عن 5 ثوان لإزالة البقع الزائدة. يمكن أن تؤدي عملية الشطف لفترة طويلة إلى إزالة الكثير من الألوان ، بينما قد لا يسمح الشطف لفترة كافية بالبقاء على خلايا سالبة الجرام.
  3. استخدم قطارة لتطبيق اليود غرام على الشريحة لإصلاح البنفسجي الكريستال على جدار الخلية. دعه يجلس لمدة 1 دقيقة.
  4. شطف الشريحة مع الكحول أو الأسيتون حوالي 3 ثوان ، تليها على الفور مع شطف لطيف باستخدام الماء. ستفقد الخلايا سالبة الجرام اللون ، بينما ستبقى الخلايا الموجبة للجرام بنفسجية أو زرقاء. ومع ذلك ، إذا تم ترك مزيل اللون لفترة طويلة ، فسوف تفقد كل الخلايا لونها!
  5. ضع اللطخة الثانوية ، سافران ، واتركها لمدة دقيقة واحدة. شطف بلطف بالماء لا يزيد عن 5 ثوان. يجب أن تكون الخلايا سلبية الغرام ملطخة باللون الأحمر أو الوردي ، في حين أن الخلايا الموجبة للجرام ستظل أرجوانية أو زرقاء.
  6. عرض الشريحة باستخدام المجهر المركب. قد تكون هناك حاجة إلى التكبير من 500x إلى 1000x لتمييز شكل الخلية وترتيبها.

أمثلة من مسببات الأمراض إيجابية الجرام وسلبية الجرام

لا ترتبط جميع البكتيريا التي تحددها وصمة الغرام بالأمراض ، ولكن بعض الأمثلة المهمة تشمل:

  • كوتش إيجابية الجرام (الجولة) -المكورات العنقودية الذهبية
  • cocci سالبة الجرام -النيسرية السحائية
  • عصيات إيجابية الجرام (قضبان) -عصية الجمرة الخبيثة
  • عصيات سلبية الغرام -الإشريكية القولونية


شاهد الفيديو: DOCUMENTAL - EL DESASTRE DEL PRESTIGE -DOCUMENTALES NATIONAL GEOGRAPHIC COMPLETO,documental 2016 (يونيو 2021).